Hallo!

Ich hab da ein paar Ungereimtheiten beim Durchgehen von den Prüfungsfragen

Kunert:
"What is the advantage of inserting the gene for EBNA1 during transient expression? " --> höhere Transformationseffizienz??? (will sie da auch mehr über HEK.EBNA Zellen hören?)

"Name methods for extraction of AB-genes after immunization of lab animals?"
--> Hybridomtechnologie? oder nur den Unterpunkt wo ich schon die produzierenden Hybrdomklone hab und die AB charakterisieren will - also Screening (PCR, Agarosegel?)

DAAANNNKE für Inputs und noch erfolgreiches Lernen!

Zur ersten Frage:
Soweit ich das verstanden habe, ist EBNA-1 unter Kontrolle des CMV Promoters und HEK Zellen exprimieren ja das E1a Protein von Adenovirus 5. E1a verstärkt den CMV Promoter, was zu erhöhter EBNA-1 Expression führt, welches wiederum trans-aktivierend auf den ori des Epstein Barr Virus (oriP) wirkt.

HEK.EBNA Zellen werden deshalb gmeinsam mit Vektoren verwendet, die einen oriP besitzen. Vorteile dieser Vekotren: sehr hohe Transfektionshäufigkeit, relativ geringe Mutationsrate (1:10^5), "tend to not rearrange" (bissi blöd zu übersetzen), persistieren im Nukleus als multi-copy Episome.


Zur zweiten Frage:
Um die Gene aus einem immunisierten Labortier zu extrahieren muss man die mRNA isolieren und die cDNA mittels reverser Transkriptase erstellen = first strand synthesis. Dazu verwendet man entweder oligo(dT) primer (die am poly-A-tail am 3'-Ende der mRNA hybridisieren und unspezifisch alle mRNA Moleküle mit einem poly-A-tail amplifizieren) oder aber besser Gen-spezifische primer für die konstante Region, ebenfalls am 3'-Ende (nur nicht ganz so weit). Die mRNA sieht so aus: 5'-V-D-J-C-PolyA-3' und entsteht aus der template (non-coding) DNA 3'-V-D-J-C-5' welche wieder mit der cDNA übereinstimmt.

Wenn man die cDNA hat, muss man nun den zweiten Strang synthetisieren. Dazu kann man eine PCR mithilfe von degenerierten (forward) VH bzw. VL primern durchführen. Ich denke dabei handelt es sich um primer für die flanking region FR1. Jetzt wurde der zweite Strang erstellt.

Alternativ kann man auch eine 5'-RACE machen, bei der ein homopolymer tail durch terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) an das 3'-Ende der cDNA angehängt wird, wenn nur eine Art von Nukleosid-Triphosphat (z.B. dCTP) anwesend ist. Wie genau das funktioniert weiß ich nicht ^^ Angeblich setzt sich ein sense Adapter auf den homopolymer tail und ein Gen-spezifischer reverse primer auf die konstante Region des eben synthetisierten second strands.

Danach kloniert man die DNA in einen sequencing-Vektor und stopft es in einen Sequenzierer.


Ps: Welche Unterpunkte meinst du mit PCR/Agarosegel?

Danke!

Ihre Art zu fragen liegt mir teilweise nicht

Wo hast Du das zur Isolierung her? (Folien?)

Nur noch zum Verständnis: Mache ich diese Extraktion nach der Immunisierung um die AK, welche die Maus produziert zu analysieren bevor ich dann die aufwendige Hybridomtechnologie starte / mache ich das am Ende der Hybridomtechnologie wo ich bereits AK-produzierende Hybridomklone isoliert habe und deren AK charakterisieren möchte?

Nein, das hab ich mir im Internet zusammengesucht (hat auch etwas gedauert) - gut dass Firmen, die sowas anbieten, auch eine Erklärung dazuschreiben ^^

Normalerweise erstellt man zuerst Hybridom-Zellen, vereinzelt sie in wells, vermehrt sie darin (=idente Klone in den Wells) und testet sie mittels ELISA auf ihre Affinität zum Antigen. Dann folgt das Hybridoma-sequencing der best binders.

Beim Antibody Phage Display verwendet man B-Zellen von nicht-immunisierten Menschen, um eine library zu erstellen. Durch reverse Transkription bekommt man dadurch die Gesamtheit des Antikörper-Repertoirs eines Individuums. Nach der PCR werden die Gene der variablen Domänen als scFv mit dem Gen des pIII minor capdis protein in den Vektor (z.B. Phagemid pComb3X) fusioniert. Dann folgt das Biopanning.

hey! in den unterlagen hab ich bis jetzt noch keine eindeutige antwort auf die frage
Differences of media composition for animal / bacterial cell cultures (related to carbon source, nitrogen source, vitamins, hormons,...)
nur welche bestandteile es gibt, aber nicht welche spezifisch für eine zellkultur-art sind könnte mir da jemand helfen?

Typisches bakterielles Medium is ein LB Medium. Das besteht aus NaCl, Peptone und Hefeextrakt, der wiederum aus Peptiden, Aminosäuren (20 essentielle) und Vitaminen besteht (vor allem B Vitamine).
Dementsprechend hat man eine hohe Konzentration an Proteinen im Medium. Die Vitamine werden vor allem als Coenzyme/growth factors gebraucht und eine direkte Glukose-Zugabe hat man oft nicht. Als Kohlenstoffquelle wird also alles verwendet, was der Hefeextrakt so mitbringt.

Für tierische Medien hingegen sind vernünftige C-Quellen wichtig. Glukose wird ja zum Beispiel mit einer Konzentration von bis zu 4.5 g/L (also fast 5%) zugegeben. Genauso wie growth hormones (HITES) nötig sind und growth factors (EGF) um das Wachstum zu ermöglichen.
Außerdem wird Glutamin (nicht-essentielle Aminosäure) oft zusätzlich zu z.B. Kälberserum hinzugefügt zum Medium, da es wichtig für Proteinsynthese, Purin/Pyrimidin Synthese, etc. ist.